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L'ARN Hélicase DED1 de Leishmania

PHC : Utique
Codes du projet : 17G0820 -- Campus N° 37063TG
Domaine : Biologie, médecine, santé
Intitulé : L'ARN Hélicase DED1 de Leishmania
Porteur(s) : TANNER Kyle, BARHOUMI Mourad
Date de début : 01/01/2020
Date de fin : 31/12/2019

Dans ce projet, nous avons choisi d’étudier plus particulièrement la protéine Ded1 de Leishmania. D’une part, cette protéine présente de très bonnes activités enzymatiques in vitro, ce qui est très intéressant pour le projet. D’autre part, nous avons pu montrer que de nombreux homologues de Ded1 pouvaient compenser partiellement une délétion de ce gène chez la levure Saccharomyces cerevisiae. Ainsi, la levure peut-être un outil génétique de choix, facile à utiliser, pour tester in vivo l’activité de Ded1 de Leishmania. Nous avons déjà utilisé cette même approche lors d’un travail réalisé sur cette même protéine chez le pathogène Candida albicans (Frota de Carvalho, unpublished data). De façon intéressante, nous avons pu montrer que même si cette protéine était capable de complémenter une souche de levure délétée pour le gène codant pour Ded1, les propriétés enzymatiques de ces 2 protéines étaient très différentes (préference pour certains ions, pH optimal, réponse à la rocaglamide, silvestrol...). Ceci montre qu’il est possible de cibler spécifiquement des protéines homologues de différents organismes.

Objectifs

Au cours de ce projet, nous nous proposons de :
1) Déterminer les gènes Ded1 homologues chez l’espèce L. infantum par une approche bioinformatique.
2) Faire une étude phylogénétique de la protéine Ded1 chez différentes espèces du genre Leishmania.
3) Invalider le gène DED1 de Leishmania, afin de prouver son caractère essentiel.
5) Confirmer génétiquement que le gène choisi est bien l’homologue de DED1 de levure par des tests de complémentation; de tester également des mutants de cette protéine chez la levure S. cerevisiae.
5) Cloner, exprimer et purifier la protéine recombinante Ded1 de Leishmania afin de caractériser les activités biochimiques de
cette protéine.
6) Caractériser l’expression de la protéine Ded1 chez Leishmania.
7) Etudier le profil d’expression de la protéine Ded1 au cours de la croissance du parasite L. infantum.
8) Déterminer la localisation cellulaire de la protéine Ded1 de L. infantum, au niveau du promastigote et de l’exosome de  Leishmania, et dans des macrophages infectés par L. infantum.
9) Tester des composés dans le but de trouver des inhibiteurs spécifiques de Ded1 de Leishmania.

Résultats

1ere année: Notre premier objectif est d’identifier les “vrais homologues” de Ded1/DDX3 de L. infantum.
2e année: Les protéines purifiées seront ensuite caractérisées afin d’optimiser leurs activités enzymatiques.
Au cours de la deuxième année, on pourra également étudier l’expression de la protéine au niveau promastigote et amastigote.
3e année: Caractérisation des propriétés biologiques de Ded1.
Nous pourrons également faire des expériences de “pulldown” en utilisant des anticorps anti-Ded1 de Leishmania afin d’isoler les complexes, et identifier les partenaires associés à Ded1 dans différents tissus, par exemple dans les exosomes du parasite L. infantum dans différentes conditions de culture (variation du température et du pH) comme il a été décrit précédemment (3-5).
Enfin, nous testerons l’effet de composés tels que la rocaglamide ou d’autres composés, sur l’activité enzymatique de Ded1 de Leishmania en comparaison avec la protéine de levure et la protéine humaine (qui est plus difficile à purifiée). Nous pourrons également regarder si Ded1 de Leishmania est une protéine essentielle en utilisant le système CRISPR-cas9 (7).

Informations supplémentaires

CNRS - UMR 8261

Partenaire français
Paris
http://www.dr2.cnrs.fr/

Laboratoire(s) ou unité(s) de recherche
Expression Génétique Microbienne (CNRS UMR)


Responsable(s)
Kyle TANNER - CNRS UMR - Paris - Tél :33158415237 - Email :kyle.tanner@ibpc.fr

Institut Pasteur de Tunis/Université Tunis El Manar

Partenaire tunisien
Tunis-Bélvédère
http://www.pasteur.tn

Laboratoire(s) ou unité(s) de recherche
Laboratoire d’épidémiologie moléculaire et pathologie expérimentale appliquée aux maladies infectieuses (MEEP)


Responsable(s)
Mourad BARHOUMI - MEEP - Tunis-Bélvédère - Tél :21671783022 - Email :mourad.barhoumi@pasteur.rns